EMB agars pret MacConkey agaru: barotņu izvēle un interpretācija

Students uzsēj vienu un to pašu ūdens paraugu uz divām platēm. Uz vienas parādās tumšas kolonijas ar zaļu metālisku spīdumu. Uz otras parādās koši rozā kolonijas ar izplūdušu halo. Abas plates inokulēja no vienas un tās pašas mēģenes, inkubēja blakus un nolasīja vienā un tajā pašā laikā. Students jautā, kura plate ir pareiza.

Pareizas ir abas plates. Tās atbild uz dažādiem jautājumiem. Apjukums rodas, ja abas barotnes uzskata par savstarpēji aizvietojamiem zarnu baktēriju skrīninga līdzekļiem. Tām ir kopīgs mērķis — selektīvi veicināt gramnegatīvu zarnu mikroorganismu augšanu un atšķirt laktozes fermentētājus no nefermentētājiem —, taču šo mērķi tās īsteno ar atšķirīgu ķīmiju un atšķirīgu vizuālo loģiku. Kad ir saprasti abi pamatprincipi, barotnes izvēle un koloniju nolasīšana kļūst par ierastu procedūru.

Īsā atbilde

EMB agarā izmanto divas krāsvielas — eozīnu Y un metilēnzilo —, kas pilda divas funkcijas: tās nomāc grampozitīvu mikroorganismu augšanu un izgulsnējas ap intensīviem skābes veidotājiem, radot tumšas kolonijas, klasiskā gadījumā ar metāliski zaļu spīdumu Escherichia coli kolonijām. MacConkey agarā šīs funkcijas ir nodalītas: žults sāļi kopā ar kristālvioleto nomāc grampozitīvus mikroorganismus, laktoze nodrošina fermentācijas substrātu, bet neitrālsarkanais norāda uz skābes veidošanos ar rozā vai sarkanu koloniju krāsojumu. Ja uzdevums ir uzskatāmi demonstrēt iespējamu E. coli klātbūtni, EMB ir piemērota izvēle. Ja uzdevums ir skaidri nošķirt rozā laktozes fermentētājus no bezkrāsainiem nefermentētājiem, īpaši fēču vai urīna paraugu darba plūsmās, MacConkey parasti ir vieglāk nolasāms. Neviena no šīm platēm neļauj identificēt mikroorganismu tikai pēc krāsas.

EMB: krāsvielas, kas vienlaikus selektē un indicē

EMB princips apvieno selekciju un indikāciju vienās un tajās pašās molekulās. ASM eozīna-metilēnzilā agara protokolā EMB aprakstīts kā selektīva un diferenciāla barotne, kurā krāsvielu pāris kavē daudzu grampozitīvu mikroorganismu augšanu, savukārt laktozes fermentācija veicina krāsvielu uzņemšanu un izgulsnēšanos. Standarta Levine formulā ir peptons, laktoze, fosfāts, eozīns Y, metilēnzilais un agars, kā norādīts FDA BAM metodē Levine EMB agarā. Ņemiet vērā, ka vecākās EMB receptēs dažkārt līdztekus laktozei pievienoja saharozi, savukārt Levine EMB satur laktozi bez saharozes, tādēļ dokumentējiet, kuru formulējumu izmanto jūsu laboratorija.

EMB nolasīšana nozīmē krāsvielu uzvedības interpretēšanu. Intensīva laktozes fermentācija rada pietiekami daudz skābes, lai izraisītu izteiktu krāsvielu izgulsnēšanos, piešķirot E. coli tumši zilus līdz melnus koloniju centrus un klasiskā gadījumā metāliski zaļu spīdumu atstarotā gaismā. Vājāki fermentētāji, piemēram, Enterobacter un Klebsiella, parasti veido rozā līdz violetas gļotainas kolonijas bez šāda spīduma. Nefermentētāji, piemēram, Salmonella, Shigella un Proteus, parasti veido bezkrāsainas vai caurspīdīgas kolonijas, jo tie nerada strauju skābes pieaugumu, kas izraisa krāsvielu izgulsnēšanos. Grampozitīvu mikroorganismu augšana parasti tiek nomākta, taču nomākuma pakāpe atšķiras atkarībā no celma un produkta. Pilna krāsvielu preparātu ķīmija, tostarp skaidrojums, kāpēc metilēnzilais vispār darbojas kā katjoniska krāsviela, ir atsevišķas diskusijas par krāsvielu formulējumiem tēma, bet vispārīgais mikroskopijas konteksts ir aplūkots krāsošanas metožu atlantā. Šajā rakstā uzmanība pievērsta plašu izvēlei un rezultātu nolasīšanai.

Iepriekš redzamais attēls ir ilustratīvs. Tas parāda sagaidāmo vizuālo loģiku: EMB platē tumšas kolonijas ar spīdumu, rozā gļotainas kolonijas un bālas kolonijas, bet MacConkey platē — rozā pretstatā bālām kolonijām. Izmantojiet to, lai apgūtu raksturīgo ainu, bet pēc tam katru secinājumu pārbaudiet pret fotografētām kontrolēm un tieši jūsu laboratorijā izmantotās barotnes produkta instrukciju.

MacConkey: nodalītas funkcijas, vienkāršāks vizuālais princips

MacConkey princips katru funkciju piešķir atsevišķai sastāvdaļai. ASM MacConkey agara protokolā izmantots tas pats selektīvas un diferenciālas barotnes raksturojums, bet FDA BAM metodē MacConkey agarā uzskaitītas funkcionālās sastāvdaļas: peptoni, laktoze, žults sāļi, sāls, neitrālsarkanais, kristālvioletais un agars. Žults sāļi kopā ar kristālvioleto selektīvi kavē grampozitīvus mikroorganismus. Laktoze nodrošina fermentācijas substrātu. Neitrālsarkanais darbojas kā pH indikators, skābes veidošanās vietās kļūstot rozā līdz sarkans, bet intensīvas fermentācijas gadījumā apkārt kolonijām reizēm izgulsnējas arī žults.

Nolasīšanas princips ir apzināti vienkāršs: rozā nozīmē laktozes fermentētāju, bet bezkrāsains vai bāls — nefermentētāju. E. coli ir rozā līdz sarkans, bieži ar žults izgulsnējumu halo. Klebsiella un Enterobacter ir rozā un bieži gļotaini kapsulas dēļ. Salmonella, Shigella, Proteus un daudzas citas gramnegatīvas nūjiņas ir bezkrāsainas. Mācību laboratorijās ir vēl viena priekšrocība: žults sāļi parasti samazina Proteus spietošanu, tādēļ MacConkey agarā izolētas kolonijas iegūt ir vieglāk nekā neselektīvās barotnēs, lai gan nomākums nav absolūts un gadījumos, kad galvenais mērķis ir spietošanas kontrole, ir pieejamas alternatīvas bez sāls.

Molekulārais iemesls, kāpēc krāsvielas uzvedas šādi, ir saistīts ar lādiņu un struktūru. Metilēnzilais ir katjoniska fenotiazīna krāsviela, kuras struktūra un īpašības izskaidro tās afinitāti pret skābām baktēriju virsmām; tā pati afinitāte darbojas arī tad, kad tā izgulsnējas skābās zonās EMB agarā.

Salīdzinājums īsumā

Lasiet tabulu kā lēmumu pieņemšanas procedūru. Ja uzdevumā studentiem jāredz fermentācijas intensitātes gradācija ar vienu īpaši izteiktu gala reakciju, to labi parāda EMB. Ja uzdevumā pirms bioķīmiskas apstiprināšanas vajadzīga ātra bināra šķirošana, to labi parāda MacConkey.

Kura barotne kuram paraugam

Ūdens analīzes mācību uzdevumos, kuru mērķis ir orientējoši atpazīt fekālos koliformus vai E. coli, EMB ir pievilcīga izvēle, jo spīdums ir vizuāli izteikts. MacConkey arī ir piemērots zarnu gramnegatīvo mikroorganismu audzēšanai un vēsturiski ir izmantots ūdens analīzēs, taču neviena no šīm platēm neaizstāj reglamentētu ūdens analīzes metodi, kurā atkarībā no testa var būt noteiktas tādas barotnes kā modificētais mTEC vai MI. Pārbaudiet metodi, kuru jūsu laboratorijai ir pienākums ievērot.

Fēču paraugu tipa uzdevumos, kuros fermentētāji jāatdala no nefermentētājiem, MacConkey parasti ir noderīgāks no abiem. Praktiskā darbā ar fēču paraugiem Salmonella vai Shigella noteikšanai parasti papildus izmanto selektīvākas zarnu baktēriju barotnes, piemēram, XLD vai Hektoen enteric, nevis paļaujas tikai uz MacConkey.

Urīna paraugu mācību uzdevumos, kas imitē klīnisko darba plūsmu, MacConkey kombinē ar asins agaru. MacConkey nodrošina sākotnēju gramnegatīvo mikroorganismu nošķiršanu, savukārt asins agars ļauj augt mikroorganismiem, kurus MacConkey nomāc. Šis pāris ir standarta pieeja klīniskajos urīna kultūras uzsējuma aprakstos.

Tīri konceptuālai mācīšanai izmantojiet abus. EMB māca, ka fermentācijas intensitātei ir nozīme un viena molekula var pildīt divas funkcijas. MacConkey māca modulāru uzbūvi: selektors, substrāts un indikators ir nodalīti. Studenti, kuri uz abām barotnēm blakus uzsēj zināmu E. coli, zināmu Klebsiella aerogenes un zināmu Salmonella kultūru, pēc tam reti vairs sajauc abu barotņu darbības loģiku.

Nolasīšanas kļūdas, kas atkārtojas katru semestri

Visbiežākā kļūda ir identificēšana tikai pēc krāsas. Rozā kolonija MacConkey agarā var būt E. coli, Klebsiella, Enterobacter vai cits fermentētājs. Bezkrāsaina kolonija var būt Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas vai cits nefermentētājs. Krāsa ir skrīninga fenotips, kas nosaka turpmāko apstiprinošo izmeklēšanu, piemēram, Grama krāsošanu, oksidāzes testu, bioķīmiskos paneļus vai instrumentālu identifikāciju, nevis sugas nosaukumu.

Otra kļūda ir pārāk liela nozīmes piešķiršana spīduma neesamībai. Dažām īstām E. coli kolonijām, īpaši izolētām kolonijām, EMB agarā metāliskais spīdums ir vājš vai tā nav vispār. Spīduma neesamība neizslēdz E. coli, un tā klātbūtne to nepierāda. Uztveriet spīdumu kā orientējošu pazīmi.

Trešā kļūda ir dažāda vecuma plašu salīdzināšana. Aizkavēti laktozes fermentētāji pēc ilgstošas inkubācijas MacConkey agarā var kļūt rozā, tādējādi padarot mazāk skaidru fermentētāju un nefermentētāju nošķīrumu. Nolasiet rezultātus laboratorijas noteiktajā laikā un kopā ar rezultātu dokumentējiet inkubācijas ilgumu.

Ceturtā kļūda ir jauktas augšanas interpretēšana kā viena mikroorganisma augšana. Rozā kolonija blakus bezkrāsainai kolonijai norāda uz diviem fenotipiem, nevis starpstāvokli. Izvēlieties labi izolētas kolonijas un katru morfotipu apstrādājiet atsevišķi. Gļotaina tekstūra rada līdzīgu slazdu: gan Klebsiella, gan Enterobacter var izskatīties gļotaini, tāpēc kapsula viena pati nenosaka nosaukumu. Mikroorganisms, ko agrāk mācīja kā Enterobacter aerogenes, tagad klasificēts kā Klebsiella aerogenes, kas izskaidro, kāpēc vecākās tabulas un jaunākie nosaukumi šķiet pretrunīgi.

Kontroles un noslēguma princips

Katrā sesijā izmantojiet fotografētas vai svaigas kontroles: E. coli spēcīgas fermentācijas reakcijai, Klebsiella aerogenes gļotainai fermentācijai bez klasiskā spīduma, Salmonella celmu bezkrāsainai nefermentētāja reakcijai un Staphylococcus aureus, lai pārbaudītu grampozitīvu mikroorganismu nomākumu tieši jūsu izmantotajā produktā. Celmu numurus un pieņemšanas kritērijus saskaņojiet ar ražotāja instrukciju, jo selektivitāti ietekmē žults, kristālvioletā un krāsvielu saturs.

Pie darba galda atcerieties vienu teikumu. EMB izmanto krāsvielas, kas gan selektē, gan indicē, nodrošinot izteiktu E. coli signālu, bet padarot nolasīšanu niansētāku. MacConkey nodala selekciju no indikācijas, nodrošinot vienkāršu rozā un bālu koloniju nošķiršanu, taču sniedzot mazāk informācijas par fermentācijas intensitāti. Izvēlieties barotni, kuras princips atbilst jautājumam, krāsu apstipriniet ar atbilstošiem testiem, un abas plates pārstās konkurēt un sāks viena otru papildināt.